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PCR試劑盒基本反應(yīng)步驟及其注意事項說明

更新日期: 2020-11-23
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  PCR技術(shù)的基本原理類似于DNA的天然復(fù)制過程,其特異性依賴于與靶序列兩端互補(bǔ)的寡核苷酸引物。DNA的半保留復(fù)制是生物進(jìn)化和傳代的重要途徑。雙鏈DNA在多種酶的作用下可以變性解旋成單鏈,在DNA聚合酶的參與下,根據(jù)堿基互補(bǔ)配對原則復(fù)制成同樣的兩分子拷貝。
  
  在實驗中發(fā)現(xiàn),DNA在高溫時也可以發(fā)生變性解鏈,當(dāng)溫度降低后又可以復(fù)性成為雙鏈。因此,通過溫度變化控制DNA的變性和復(fù)性,加入設(shè)計引物,DNA聚合酶、dNTP就可以完成特定基因的體外復(fù)制。
  
  PCR試劑盒由變性--退火--延伸三個基本反應(yīng)步驟構(gòu)成:
  
  1、模板DNA的變性:模板DNA經(jīng)加熱至93℃左右一定時間后,使模板DNA雙鏈或經(jīng)PCR擴(kuò)增形成的雙鏈DNA解離,使之成為單鏈,以便它與引物結(jié)合,為下輪反應(yīng)作準(zhǔn)備。
  
  2、模板DNA與引物的退火(復(fù)性):模板DNA經(jīng)加熱變性成單鏈后,溫度降至55℃左右,引物與模板DNA單鏈的互補(bǔ)序列配對結(jié)合。
  
  3、引物的延伸:DNA模板--引物結(jié)合物在72℃、DNA聚合酶(如TaqDNA聚合酶)的作用下,以dNTP為反應(yīng)原料,靶序列為模板,按堿基互補(bǔ)配對與半保留復(fù)制原理,合成一條新的與模板DNA鏈互補(bǔ)的半保留復(fù)制鏈。
  
  注意事項:
  
  由于PCR反應(yīng)非常靈敏可以擴(kuò)增目的基因序列超過1000萬倍,在使用Taq酶時請注意避免微量待擴(kuò)增DNA的污染,并盡量考慮設(shè)置不加模板的空白對照以確認(rèn)是否有待擴(kuò)增DNA的污染。
  
  TaqDNApolymerase在PCR過程中每循環(huán)的出錯幾率約為2.2×10-5,對于大于1kb的DNA的片段的克隆推薦使用出錯幾率更低的DNA聚合酶。對于普通的PCR或RT-PCR定性檢測或定量檢測,TaqDNApolymerase是理想選擇。
  
  本產(chǎn)品僅限于專業(yè)人員的科學(xué)研究用,不得用于臨床診斷或治療,不得用于食品或藥品,不得存放于普通住宅內(nèi)。
  
  為了您的安全和健康,請穿實驗服并戴一次性手套操作。
  
  
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