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艱難梭菌(TCD-B)核酸檢測試劑盒(熒光PCR法)

更新日期: 2022-04-23
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                艱難梭菌(TCD-B)核酸檢測試劑盒(熒光PCR法)

【產(chǎn)品名稱】

商品名稱:艱難梭菌(TCD-B)核酸檢測試劑盒(熒光 PCR 法)

Name :Diagnostic Kit for Clostridiumdifficile tcd-B gene (Real-Time PCR Method)

【包裝規(guī)格】50T/盒

【預(yù)期用途】

本試劑盒適用于檢測從水樣糞便等標(biāo)本中分離出的毒素 B 型艱難梭菌,用于艱難梭菌的輔助診斷,其檢測結(jié)果僅供臨床參考。

【檢驗原理】

本試劑盒用一對艱難梭菌毒素 B 基因特異性引物,結(jié)合一條特異性熒光探針,用一步法熒光 RT-PCR 技術(shù)對艱難梭菌毒素 B 基因進(jìn)行體外擴(kuò)增檢測,用于臨床上對可疑感染者的病原學(xué)診斷。

【試劑組成】

包裝規(guī)格

50T/盒

TCD-B 反應(yīng)液

500μL×2 管

酶液

50μL×1   管

TCD-B 陽性質(zhì)控品

50μL ×1 管

陰性質(zhì)控品

250μL   ×1 管

說明:不同批號的試劑盒組分不可交互使用。

【儲存條件及有效期】

-20℃±5℃,避光保存、運(yùn)輸、反復(fù)凍融次數(shù)不超過 5 次,有效期 12 個月。

【適用儀器】

ABI 、安捷倫 MX3000P/3005P、LightCycler、Bio-Rad、Eppendorf 等系列熒光定量 PCR 檢測儀。

【標(biāo)本采集】

取水樣便 0.5~1mL

【保存和運(yùn)輸】

上述標(biāo)本短期內(nèi)可保存于-20℃,長期保存可置-70℃,但不能超過 6 個月,標(biāo)本運(yùn)送應(yīng)采用 2~8℃冰袋運(yùn)輸,嚴(yán)禁反復(fù)凍融。

【使用方法】

1.  樣品處理(樣本處理區(qū))

1.1     樣本前處理

13000rpm 離心 2min,去盡上清

1.2    核酸提取

推薦采用上海烜雅生物科技有限公司生產(chǎn)的核酸提取或純化試劑(磁珠法或離心柱法)進(jìn)行核酸提取,請    按照試劑說明書進(jìn)行操作。

2.  試劑配制(試劑準(zhǔn)備區(qū))

根據(jù)待檢測樣本總數(shù),設(shè)所需要的 PCR 反應(yīng)管管數(shù)為 N(N=樣本數(shù)+1 管陰性對照+1 管陽性對照;反應(yīng)管數(shù)每滿 10 份,多配制 1 份),每測試反應(yīng)體系配制如下表:

試劑

TCD-B 反應(yīng)液

酶液

用量

20μL

1μL

將混合好的測試反應(yīng)液分裝到 PCR 反應(yīng)管中,21μL/管。

3.  加樣(樣本處理區(qū))

將步驟 1 提取的核酸、陽性質(zhì)控品、陰性質(zhì)控品各取 4μL,分別加入相應(yīng)的反應(yīng)管中,蓋好管蓋,混勻, 短暫離心。

4.  PCR 擴(kuò)增(核酸擴(kuò)增區(qū))

4.1  將待檢測反應(yīng)管置于熒光定量 PCR 儀反應(yīng)槽內(nèi);

4.2  設(shè)置好通道、樣品信息,反應(yīng)體系設(shè)置為 25μL;

熒光通道選擇: 檢測通道(Reporter Dye)FAM, 淬滅通道(Quencher Dye)NONE,ABI 系列儀器請勿選擇 ROX 參比熒光,選擇 None 即可。

4.3  推薦循環(huán)參數(shù)設(shè)置:

步驟

循環(huán)數(shù)

溫度

時間

收集熒光信號


 

1

1 cycle

95℃

10min

2

40 cycles

94℃

15sec

55℃

30sec

5.  結(jié)果分析判定

5.1  結(jié)果分析條件設(shè)定

設(shè)置 Baseline 和 Threshold:一般直接按機(jī)器自動分析的結(jié)果分析,當(dāng)曲線出現(xiàn)整體傾斜時,根據(jù)分析后圖像調(diào)節(jié) Baseline 的 start 值(一般可在 3~15 范圍內(nèi)調(diào)節(jié))、stop 值(一般可在 5~20 范圍內(nèi)調(diào)節(jié)),以及

Threshold 的 Value 值(上下拖動閾值線至高于陰性對照),重新分析結(jié)果。

5.2  結(jié)果判斷

陽性:檢測通道 Ct 值≤35,且曲線有明顯的指數(shù)增長曲線;

可疑:檢測通道 35<Ct 值≤38,建議重復(fù)檢測,如果檢測通道仍為 35<Ct 值≤38,且曲線有明顯的增長曲線, 判定為陽性,否則為陰性;

陰性:樣本檢測結(jié)果 Ct 值>38 或無 Ct 值。

6.  質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)

陰性質(zhì)控品:Ct>38 或無 Ct 值顯示;

陽性質(zhì)控品:擴(kuò)增曲線有明顯指數(shù)生長期,且 Ct 值≤32; 以上條件應(yīng)同時滿足,否則實驗視為無效。

1.  檢測方法的局限性

1. 樣本檢測結(jié)果與樣本收集、處理、運(yùn)送以及保存質(zhì)量有關(guān);

2. 樣本提取過程中沒有控制好交叉污染,會出現(xiàn)假陽性結(jié)果;

3. 陽性對照、擴(kuò)增產(chǎn)物泄漏,會導(dǎo)致假陽性結(jié)果;

4. 病原體在流行過程中基因突變、重組,會導(dǎo)致假陰性結(jié)果;

5. 不同的提取方法存在提取效率差異,會導(dǎo)致假陰性結(jié)果;

6. 試劑運(yùn)輸,保存不當(dāng)或試劑配制不準(zhǔn)確引起的試劑檢測效能下降,出現(xiàn)假陰性或定量檢測不準(zhǔn)確的結(jié)果;

7. 本檢測結(jié)果僅供參考,如須確診請結(jié)合臨床癥狀以及其他檢測手段。

【注意事項】

1. 所有操作嚴(yán)格按照說明書進(jìn)行;

2. 試劑盒內(nèi)各種組分使用前應(yīng)自然融化,*混勻并短暫離心;

3. 反應(yīng)液應(yīng)避光保存;

4. 反應(yīng)中盡量避免氣泡存在,管蓋需蓋緊;

5. 使用一次性吸頭、一次性手套和各區(qū)專用工作服;

6. 樣本處理、試劑配制、加樣需在不同區(qū)進(jìn)行,以免交叉污染;

7. 實驗完畢后用 10%次氯酸或 75%酒精或紫外燈處理工作臺和移液器;

8. 試劑盒里所有物品應(yīng)視為污染物對待,并按照《微生物生物醫(yī)學(xué)實驗室生物安全通則》進(jìn)行處理。

【生產(chǎn)企業(yè)】

企業(yè)名稱:上海晅科生物科技有限公司


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