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霍亂弧菌O139(VC O139)核酸檢測(cè)試劑盒的操作使用

更新日期: 2023-04-11
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霍亂弧菌O139(VC O139)核酸檢測(cè)試劑盒適用于ABI 、安捷倫 MX3000P/3005P、LightCycler、Bio-Rad、Eppendorf 等系列熒光定量 PCR 檢測(cè)儀。
1、試劑配制(試劑準(zhǔn)備區(qū))
根據(jù)待檢測(cè)樣本總數(shù),設(shè)所需要的 PCR 反應(yīng)管管數(shù)為 N(N=樣本數(shù)+1 管陰性對(duì)照+1 管陽(yáng)性對(duì)照;反應(yīng)管數(shù)每滿10份,多配制 1份),每測(cè)試反應(yīng)體系配制如下表:將混合好的測(cè)試反應(yīng)液分裝到 PCR 反應(yīng)管中,21μL/管。

2、加樣(樣本處理區(qū))
將步驟1提取的核酸、陽(yáng)性質(zhì)控品、陰性質(zhì)控品各取4μL,分別加入相應(yīng)的反應(yīng)管中,蓋好管蓋,混勻, 短暫離心。
3、 PCR擴(kuò)增(核酸擴(kuò)增區(qū))
3.1  將待檢測(cè)反應(yīng)管置于熒光定量PCR儀反應(yīng)槽內(nèi);
3.2  設(shè)置好通道、樣品信息,反應(yīng)體系設(shè)置為25μL;
熒光通道選擇: 檢測(cè)通道(Reporter Dye)FAM, 淬滅通道(Quencher Dye)NONE,ABI系列儀器請(qǐng)勿選擇ROX參比熒光,選擇None即可。
3.3  推薦循環(huán)參數(shù)設(shè)置:

4、結(jié)果分析判定
4.1  結(jié)果分析條件設(shè)定
設(shè)置Baseline和Threshold:一般直接按機(jī)器自動(dòng)分析的結(jié)果分析,當(dāng)曲線出現(xiàn)整體傾斜時(shí),根據(jù)分析后圖像調(diào)節(jié)Baseline的start值(一般可在3~15范圍內(nèi)調(diào)節(jié))、stop值(一般可在5~20范圍內(nèi)調(diào)節(jié)),以及Threshold的Value值(上下拖動(dòng)閾值線至高于陰性對(duì)照),重新分析結(jié)果。
4.2  結(jié)果判斷
陽(yáng)性:檢測(cè)通道Ct 值≤35,且曲線有明顯的指數(shù)增長(zhǎng)曲線;
可疑:檢測(cè)通道35值≤38,建議重復(fù)檢測(cè),如果檢測(cè)通道仍為35值≤38,且曲線有明顯的增長(zhǎng)曲線, 判定為陽(yáng)性,否則為陰性;陰性:樣本檢測(cè)結(jié)果Ct值>38或無(wú)Ct值。
5、質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)
陰性質(zhì)控品:Ct>38 或無(wú)Ct值顯示;
陽(yáng)性質(zhì)控品:擴(kuò)增曲線有明顯指數(shù)生長(zhǎng)期,且Ct值≤32; 以上條件應(yīng)同時(shí)滿足,否則實(shí)驗(yàn)視為無(wú)效。

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